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一、单细胞RNA测序（scRNA-seq）流程简介
单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是一项突破性的技术，使我们能够在单细胞水平解析基因表达的差异。这一技术对揭示细胞多样性、追踪细胞发育过程以及深入了解疾病发生机制具有重要意义。与传统的群体RNA测序相比，scRNA-seq能够分析每一个细胞的独特基因表达谱，为我们提供了更精细的视角。
scRNA-seq的标准流程大致分为以下几个步骤：
1.单细胞分离：利用流式细胞分选、微流体或液滴微流控等技术将单个细胞分离。
2.cDNA合成与扩增：将细胞的mRNA逆转录为cDNA，并进行扩增，以便后续分析。
3.文库构建：为扩增得到的cDNA加入测序适配子，生成适合测序的文库。
4.高通量测序：使用Illumina或其他平台，对文库进行高通量测序，获得序列数据。
5.数据分析：对测序数据进行质控、聚类、差异分析等，最终获得细胞类型和基因表达模式的信息。
二、数据采集与预处理：从原始数据到表达矩阵
scRNA-seq生成的原始数据是非常庞大且复杂的，预处理是保证数据质量的关键步骤。具体步骤包括：
1.读取原始数据：原始数据一般以fastq文件格式保存，包含了每个cDNA片段的序列信息。
2.数据质控（QC）：质控过程中，去除低质量的reads，以减少技术噪声对分析的影响。常用质控指标包括细胞的总reads数、检测到的基因数目以及线粒体基因表达比例等。
3.比对与计数：将reads比对到参考基因组上，并对每个基因的reads进行计数，以生成基因表达矩阵。这一步通常使用CellRanger、STAR等软件。
4.去除双细胞与死细胞：在单细胞水平上，一些reads可能来源于双细胞或者死细胞。通过适当的滤波策略，可以有效减少这些细胞对数据分析的干扰。
5.归一化处理：对基因表达矩阵进行归一化，以消除技术偏差，便于不同细胞间的基因表达对比。
经过预处理的数据即可作为下游分析的基础。后续的分析将基于该表达矩阵进行聚类、差异基因分析和细胞类型注释等操作，从而挖掘出单细胞水平的生物学信息。
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